组织工程与再生医学 1.组织工程与再生医学 图书在版编目（CIP）数据 自医学诞生之日起，人类便梦想能够完全修复或再生出因疾病或创伤 第一章　再生生物学概论 再生是一门古老的生物学研究领域 再生是生物体的整体或器官受外力作用发生创伤而部分丢失，在剩余 两栖类四肢的再生是割处再生的经典模型，该再生过程主要由六个关 一直以来，再生生物学研究的主要内容均是围绕探讨再生过程的类型 再生过程中细胞与细胞之间的相互作用具有十分重要的作用，特别是 再生的发生并不是完全独立的一个局部反应，抛开再生的结构特性不 形态发生理论( 一、干细胞 干细胞与其周围组织细胞及细胞外基质等相互作用、相互影响 一、再生生物学在医学中的应用 与再生医学基础研究的累累硕果相比，再生医学的临床转化进程可谓 1 第一节　发育的模式控制 生物体在整个生命周期都处于动态的发育过程中 一、研究再生模式控制的动物及器官模型 (一)涡虫切割后再生的调控机制 近年来，越来越多的研究结果显示，发育与再生的模式控制之间存在 人类一直梦想着能拥有与某些低等生物相同的再生能力，能够利用此 1.郭炳冉.发育生物学模式生物.生物学教学.2008，33( 再生( 大多数情况下损伤处再生过程的结果是形成解剖修复，但在某些情况 亚等效再生( 额外再生( 大多数情况下再生结构紧密复制缺损的原结构，但一些经典实验提示 Morgan最先使用“变形再生( Tokin用“体细胞胚胎发生( 中间再生( 大多数胚胎和再生结构的生长表现为成形，在一些情况下生长定义为 尽管通过对多个不同种群的多年研究已发现大量特异且重要的形态发 本领域早期许多研究者认为复杂结构的再生是一个组织特异性( 再生的一个基本规则是从一个截除表面只能形成更远端而非近端的结 极性( 梯度( 调节( 再生区域( 形态发生场( 一个世纪前，Driesh从海胆胚胎研究的一些实验中推测，在一 一个多世纪前Bateson对大量从胚胎发生或再生中获得的复制 同样是一个世纪之前，Barfurth注意到如果一个结构被斜向 这一节介绍形态发生的调控要素并在两种完全不同实验种类即两栖动 再生生物学的实验科学始于18世纪40年代，Abraham第一 形态发生仍然是割处再生中持续的主要前沿研究，目前为止我们对于 组织工程的长期目标是体外构建的功能组织移植入体内进行修复、加 软骨形态发生在骨发育动态中的关键限速步骤，软骨是骨建构的初始 形态发生是连续的多级串联，BMPs调节每个关键步骤:趋化、有 胚胎中胚层来源的间充质细胞是骨、软骨、肌腱、韧带和肌肉的前体 形态发生蛋白在整形外科组织工程的局部基因治疗技术中应用的研究 人类衰老过程中由于骨和关节的磨损和撕裂将不可避免地面临行动受 经典形态发生理论认为调控性状的蛋白是呈梯度排列的，不同数量的 1. 细胞外基质( 1.纤维粘连蛋白( 蛋白聚糖( 细胞因子( 一、整合素受体通路 除整合素受体通路以外，细胞膜表面的蛋白聚糖也是细胞对细胞外基 除整合素或蛋白聚糖以外的其他细胞表面受体，也可对ECM的分子 ECM不仅具有连接、支持、保水、抗压及保护等物理学作用，还对 ECM通过与其受体的相互作用，可促进细胞增殖和存活，这一过程 细胞与ECM分子、生长因子和激素等的相互作用是调控细胞向特定 组织再生是一个非常复杂的过程 近年来对啮齿类动物和人类心脏疾病的研究中发现，心脏并不完全是 1 第一节　信号转导的途径 酪氨酸蛋白激酶( 鸟苷酸环化酶( 细胞内受体分布于胞质或核内，本质上都是配体调控的转录因子，均 在细胞中，各种信号转导分子相互识别、相互作用将信号进行转换和 Wnt基因在胚胎发育中有着广泛的表达，Wnt信号通路在动物胚 大量的研究表明Wnt信号通路在维持干细胞的干性特征，及参与干 一、Notch信号通路 Notch途径从结构到功能上，在从果蝇到人类是保守的，且在发 (一) 一、Hedgehog信号通路 在胚胎发生过程中HH以组织特异的方式促进细胞的增殖，决定胚胎 (一) 1 第一节　胚胎干细胞简介 图6-1　胚胎干细胞多向分化示意图 一、鼠胚胎干细胞的来源 第一个由体外受精的胚胎发育而来的婴儿诞生于1978年，人类E 一、胚胎干细胞形态学特征 胚胎干细胞为未分化多能性细胞，能够表达一些特异性的表面标志物 (一)胚胎干细胞的细胞周期特征 胚胎干细胞的全能性能够保证经自我更新产生的子细胞始终保留有母 维持胚胎干细胞不分化状态的机制包括内源性调控(包括细胞内蛋白 胚胎干细胞的多分化潜能使其成为细胞治疗的最好种子细胞，并且胚 成体干细胞已经被应用于一些细胞疗法，其被期望于最终使用在很多 1 第一节　简　　介 一、机体对衰老的三级响应保护机制 (一)基因组不稳定 (一)能量代谢衍生机制 (一)细胞衰老 机体的衰老伴随着组织再生减少，退行性疾病和癌症的发生增加 门控抑癌基因是负向调控细胞增殖和存活的一类关键基因，例如p1 前文讨论衰老的生物学机制时提到的线粒体功能障碍、代谢衍生机制 能量限制不仅能延缓机体衰老，同样能促进干细胞的功能或者减缓增 一、早衰基因对干细胞衰老的影响 近年来，有三个独立的研究小组同时证实，抑制肿瘤细胞生长的基因 Sirt1基因可以通过激活一种细胞途径，并有高密度脂蛋白将体 利用一种与早衰疾病沃纳综合征相关的蛋白，科学家发现了几种蛋白 一、年轻与衰老干细胞的分选方法 干细胞衰老的生物学标志主要有细胞DNA合成障碍、衰老相关β- 端粒过度缩短或功能丧失会引起DNA损伤应激反应从而导致细胞周 热量限制是唯一的、持续性的，可重现并能够广泛地延长物种的平均 氧化应激诱导的细胞衰老一直被视为衰老研究中优秀的体外模型 新抗衰老药物的开发越来越受到科学工作者和公众的关注 表观遗传修饰是多细胞生物体在进化过程中形成的一种细胞遗传的、 20世纪80年代以前，人们对衰老或长寿的科学认识还是处于一种 1 第一节　激素概述 经典的激素按化学结构大体分为三类。 激素作为信号，主要发挥转导信号的作用 1.激素与激素受体的特异性结合 激素的生理作用非常复杂，涵盖了身体发育、生长、维持、生殖等各 甲状腺激素( 钙离子广泛参与一系列的细胞和分子反应过程，维持钙离子的平衡是 胰腺分泌的主要激素是胰岛素和胰高血糖素，这两种激素对肝脏存储 生长激素( 肾上腺皮质激素( 瘦素( 一、激素对于干细胞调控作用的重要性 (一)直接作用 在一般情况下，绝大多数成体干细胞均处于静止状态，仅有少量的干 1.罗敏.分子内分泌学.北京:人民军医出版社，2003. 第一节　骨衰老及骨质疏松概述 骨骼分为长骨、短骨、扁骨和不规则骨，因为长骨发挥着主要的机体 骨稳态平衡主要表现为破骨细胞介导的骨吸收与成骨细胞介导的骨形 干细胞维持局部组织的稳态平衡，主要依靠于其数量和功能 基于基因敲除小鼠的前期研究揭示了老龄性骨质疏松与骨髓间充质干 衰老逐渐成为研究的热点，越来越多的人力和物力投入到衰老研究中 骨骼组织由骨骼细胞和钙化的胞外基质构成，Ⅰ型胶原是胞外基质的 有学者认为衰老过程是一个主动调控的过程 生物体从器官、组织到细胞等各个层次上的生命运动均是在一定力学 能量对于全身每一个器官都至关重要，机体的新陈代谢和运动均需要 一、基于干细胞的骨质疏松治疗 组织工程技术的兴起为研究骨再生与骨愈合的过程和机制，治疗骨折 1.王亚平.干细胞衰老与疾病.北京:科学出版社，2009. 第一节　iPS细胞的产生 (一)依赖病毒的转导方法 (一)健康iPS细胞的细胞和组织来源 一、体细胞重编程网络 体细胞重编程过程包括染色质结构的相当可观的修饰，也即DNA甲 一、iPS多能性的评估 完全重编程细胞仅仅通过分子特征不能直接定义为iPS细胞系，仍 关于iPS细胞的重大问题之一是它们是否与ES细胞间存在差异， 应用患者特异性的多能性干细胞来进行组织替代是再生医学的终极目 研究神经退行性疾病的一种策略是建立模拟疾病起始和进展的实验性 心血管疾病是人类疾病和死亡的一大因素，一旦出现心肌梗死，几乎 揭示iPS细胞再生医学治疗潜力的首例研究是Hanna等于20 研究证实，正常的iPS细胞被注入无法形成胰腺的PDX1突变小 一些研究团队最近报道，iPS细胞可被诱导分化为视网膜细胞，在 最理想的临床应用细胞来源应符合以下标准:易于获取，对患者风险 使用原癌基因产物c-Myc以及Klf4作为转录因子、使用整合 1. 第一节　再生医学和表观遗传学 生物学家Waddington 围绕着再生医学展开的研究已经进行了很多年，然而对于不同的模式 一、两栖动物中再生的表观调控 成熟的中枢神经系统( 一、表观遗传学和心脏再生 (一)神经再生概述 (一)骨再生现状 (一)软骨疾病概述 1 第一节　间充质干细胞的发现与概念 近年来，国外的一些学者们对MSCs有了新的认识，他们在骨髓的 一、细胞表型、自我更新和多向分化潜能 正常组织的细胞表面可以表达较多的主要组织相容性复合体Ⅰ分子( 最初认识到MSCs具有免疫调节能力( 归巢( 一、再生及再生医学的概念 再生医学治疗的主要方法有干细胞疗法、组织工程技术、克隆技术、 一、骨组织 众所周知，关节软骨的修复和再生能力极其有限，因此软骨损伤后的 肌腱和韧带组织损伤是最为常见的软组织损伤 现代医学认为，细胞能否在异位环境中存活下来是椎间盘( 近年来，MSCs的免疫调控能力逐渐受到学者们的重视，许多研究 有学者提出MSCs在体外可以分化为非骨骼系统细胞，囊括了内胚 再生医学的应用基础就是干细胞，因此干细胞的性质、数量及来源影 1 第一节　炎症与炎性微环境 炎性细胞因子( 本章所述的微环境，即指细胞所处的生长环境，包括对细胞命运(增 一、炎性微环境对干细胞生物学特性的影响 干细胞的生物学特性是受到严密调控的，也正是由于这种调控机制的 一、炎性细胞因子在组织创伤与修复中的作用 在正常人体内，微环境为干细胞提供一个保护性微环境，不受外部诱 组织修复( 1 第十四章　组织工程与再生医学研究概况 (一)再生医学的基本概念 一、组织工程与再生医学的基本原理 (一)种子细胞 一、研究进展 再生医学的很多研究还处于基础阶段，还存在大量需要解决的科学问 组织工程与再生医学产业是最具发展潜力的高新技术生物产业之一， 1 作为细胞、组织或器官再生的支架，支架材料在组织工程组织的构建 构建组织工程支架首先要考虑的是选用合适的材料，而且这些材料要 从材料工程学的角度来看，所谓组织是一种含有细胞的复合体，里面 体外构建的组织最终还是要移植到体内，因此要求使用的支架材料必 一、引言 (一)纤维材料的黏结或编织 随着计算机技术和制造技术的发展，出现了一种将二者结合的新技术 一、仿生材料在组织工程与再生医学中的应用 纳米生物材料可以分为两类:一种是适合于生物体内应用的纳米材料 水凝胶是一类具有网络结构、能大量吸收水分的沁水聚合物，具有原 细胞支架是一种新型的生物材料，它完整地保留了原有组织的立体支 骨移植材料通常包含一个或多个功能成分，如骨传导基质，为新骨生 1 第一节　细胞与材料的相互作用基础理论 组织工程与再生医学的崛起标志着医学将走出组织器官移植的范畴， 目前多种不同类型的生物材料，已被广泛地应用于组织工程中 改进生物材料与细胞的相互作用，实质上是增强细胞在材料上的黏附 一、引言 (一)生长因子在生物材料上的应用 (一)血管网络系统形成和修复过程中生长因子的作用 (一)生长因子在骨形成和修复过程中的作用 通过采用生长因子来刺激身体自然愈合过程，在生物材料的应用下， 一、引言 植入物植入体内后，立刻会有一层宿主蛋白吸附于其表面，以调节植 巨噬细胞在激活后分泌一系列的分子来促进炎症反应和伤口愈合 在过去的几十年里，我们对单核细胞、巨噬细胞、异物巨细胞和淋巴 一、引言 (一)神经损伤与再生 目前骨组织常用的生物材料包括羟基磷灰石、生物衍生骨、珊瑚、多 MSCs作为种子细胞与材料复合修复不同组织和器官的缺损、损伤 1 科学技术的快速发展，为再生医学提供了强有力的推动作用，医疗干 近20年来，三维打印技术有了巨大的进步，在麻省理工学院( 一、三维打印的技术流程 一台三维打印机可以从小到放入一个手提袋，也可以大大一辆微型面 由于实现了直接数字化制造( 一、三维打印与赝复体的制作 20世纪40年代初期，Bother发现钛与骨组织之间无不良组 干细胞是人体的原始组成部分，是一种具有多向分化潜能的特殊细胞 在组织工程骨的研究领域，由于人体骨骼的曲面比较复杂，其形状各 心脏是由肌肉、血管和软骨组成的，它们在射向整个身体的电脉冲所 很多人由于患有疾病、先天性缺陷或意外受伤而需要替换新的身体部 1 第一节　基因治疗概述 (一)基因治疗的途径 不论体外还是或体内，基因转移都需要借助一定的方法或载体才能将 外伤、炎症、肿瘤以及先天畸形等许多因素都会造成细胞和组织的损 (一)概述 (一)概述 (一)概述 (一)概述 (一)神经 一、基因修饰的安全性问题 基因治疗方法中，病毒载体的投递具有更高的转染效率和更持久的基 病毒载体和非病毒载体均存在一定的优点及缺点 1. 第一节　诱导小分子化合物的研究进展 中药是寻找抗骨质疏松药物的巨大宝库，它们来源多样化、成分多样 高通量筛选和高内涵筛选是小分子化合物目前筛选的最有效手段 一、可诱导干细胞分化的因素 胚胎干细胞( 神经元是中枢神经系统起主导功能的细胞，通过小分子诱导的方法可 心脏病后修复是再生医学的重要课题和难题 1型糖尿病是胰岛细胞被机体自身的免疫系统破坏，无法产生功能胰 作为细胞重编程研究的里程碑，2006年，Yamanaka小组 1. 目前治疗终末期器官衰竭最有效的方法仍是原位移植，然而供体器官 化学试剂处理主要是指选择适宜的化学去垢剂，通过溶解细胞膜或使 生物试剂脱细胞方法包括使用蛋白酶、核酸酶和胶原酶等，其中胰蛋 一、全器官脱细胞的灌注法 尽管脱细胞过程中的物理、化学、生物法可有效破坏细胞并去除其残 在全器官脱细胞过程中，必须采用特定的方式破坏细胞结构，才能使 在基于细胞外基质的全器官再造研究中，再细胞化研究主要包括种子 功能性再造器官的构建依赖于再细胞化时种子细胞与器官特异性三维 脱细胞基质中最初接种的细胞数量是一个可变参数，主要依赖于脱细 1.反应器类型 一、脱细胞ECM在心脏组织再生中的应用 Ugynn等报道了改进自Ott等在组织工程心脏构建中所采用的 1.全肺脱细胞进展 肾脏的组织工程研究已有十余年历史，目前的生物人工肾通过组织工 尽管当前组织工程学研究成果显著，但距离成功运用尚存在很多需要 1 随着生命科学的发展，由于损伤和病变等原因造成的组织缺损及功能 在自然状态下，动物细胞并不存在于溶液之中，而是与细胞外基质的 细胞膜片制备的关键，是通过多种方式刺激种子细胞的基质分泌，提 根据修复的需要，组织工程细胞膜片的构建方法也不同 应用温度反应性培养皿的细胞膜片技术，克服了单细胞悬液注射法的 长期以来，供体紧缺和移植排斥反应是器官移植发展的两大障碍 目前，应用细胞片层技术构建各种组织和器官主要有3种方式:将单 组织工程和再生医学是近年来方兴未艾的生物医学新领域 传统的组织工程技术中，胰蛋白酶消化细胞的单细胞悬液注射法破坏 1 组织工程皮肤产品为治疗皮肤的急性和慢性损伤提供了一个极有前景 组织工程皮肤的应用原则基本上与自体刃厚皮片相同，既可以整片使 在传统的皮肤移植治疗中，必须要考虑供区皮肤的结构和功能对移植 组织工程皮肤的构建意味着，通过进行精心的设计和制作来达到恢复 皮肤创伤需要大量的细胞来封闭创面，恢复皮肤结构 图22-1　组织工程皮肤( 到目前为止，尚没有一种组织工程皮肤可以完全重建正常皮肤的组织 受损皮肤完全恢复正常功能是组织工程皮肤修复的首要目标 许多临床操作与护理的因素都可以影响到组织工程皮肤修复皮肤损伤 组织工程皮肤机械性能方面的缺陷是导致其移植失败的主要原因之一 在使用组织工程皮肤治疗皮肤损伤之后，我们需要作出准确的评估， 自组织工程这一概念提出10年以来，该技术获得了突飞猛进的发展 (一)组织工程真皮中常用的支架材料 (一)研究现状 英国和美国的科学家发现毛囊组织的某些特定细胞，如真皮鞘和毛乳 研究表明，在成体组织及器官中普遍存在着特异的成体干细胞，问题 (一)常规浸没式全层皮肤构建方法 近年来组织工程皮肤已取得可喜的进步并初步应用于临床 一、组织工程产品安全性、有效性评价 组织工程产品的产业化需要应用人胚胎或其他组织来源的组织分离培 按国际和国内有关法规，组织工程产品属于第三类医疗器械，可长期 1. 第一节　骨组织学 (一)骨形成 塑性是以骨形状或骨结构改变为特点的过程，涉及到了骨吸收和骨形 生长因子是指对生长、发育具有广泛调节作用的活性蛋白质或多肽类 一、骨组织再生与重建的方法及策略 1995年Crane等系统提出了骨组织工程( 根据组织工程技术的基本原理与方法，应用种子细胞与可降解生物材 一、骨缺损动物模型研究 20世纪80年代出现了组织工程学研究，使临床骨移植的研究与应 一、组织工程骨的血管化研究 骨组织是一种坚硬的结缔组织，由细胞、纤维和基质成分组成 计算机辅助技术以及纳米技术等先进技术与材料的出现为组织工程骨 1. 第一节　软骨再生和软骨组织工程研究基础和背景 关节软骨的功能主要受基质特性影响 关节软骨无血液供应和神经支配，且软骨细胞的低代谢活性和高密度 一、三维构建方式对软骨再生的作用 软骨在维持组织代谢平衡的过程中，伴随着大量机械应力的作用 正常生理情况下，关节软骨无直接的血液供应，主要通过关节滑液和 软骨细胞是终末分化细胞，可以合成Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等细胞外基 间充质干细胞在体外经过诱导可以分化为软骨细胞 三维支架是组织工程研究的重要方面之一 一、软骨细胞去分化问题 软骨组织是无血管、无神经的组织，在动物机体中起到缓冲压力和减 研究显示其他如滑膜细胞，软骨膜细胞或骨膜细胞，人类外周血中的 软骨内成骨是动物体内大多数长骨的形成方式 据统计，美国每年有上百万人患有各种组织、器官丧失或功能障碍， 1 由于外伤或手术导致的周围神经缺损会导致肌肉功能丧失、感觉丧失 施万细胞是神经纤维的主要结构细胞，它呈梭形，胞体较小，有两个 周围神经有神经内膜、神经束膜和神经外膜三层支持性鞘膜，分别对 周围神经损伤可导致部分或全部的运动神经和感觉神经的功能丧失 神经再生的成功首要依赖于受损神经元的存活状态及其再生状态的转 随着生物材料的发展，多种神经支架导管陆续的出现，促进了周围神 神经干细胞( 作为可用于周围神经损伤治疗的干细胞应具备以下特性:容易获取， 皮肤组织由于面积大、再生能力强是另外一个较易获取干细胞的重要 一、神经组织移植 鉴于异体神经移植存在的缺陷，人们开始寻找自体神经移植的替代物 天然聚合物(壳聚糖、甲基纤维素、胶原、明胶、藻酸盐)、不可降 良好的纳米拓扑特性，包括沟槽、褶皱、孔隙率、结节等通过影响细 由于具有与天然细胞外基质相似的结构与特性，纳米纤维材料是被认 人体的电生理反应以及神经元交流的关键成分是由突触部位的动作电 生长因子在神经组织修复与再生中发挥着关键的作用 自体神经移植被认为是修复周围神经损伤的“金标准”，但自体神经 1. 牙病是人类最常见的疾病之一，世界卫生组织( 牙发育的基本原理对指导牙再生和牙组织工程研究起到决定性作用 牙的形成同其他器官的发育一样包括三个基本过程，首先在正确的位 以研究牙发育的模式动物小鼠为例，牙发育从胚胎发育的第8天( 牙体组织由釉质、牙本质、牙骨质三种硬组织和一种软组织-牙髓构 牙周组织包括牙周膜、牙槽骨、牙骨质和牙龈，多数学者认为，除牙 牙是通过胚胎发育过程中上皮与间充质之间一系列的相互诱导作用而 一、器官培养技术 重组试验将发育期的牙胚组织或细胞经机械分离成两组分:上皮成分 组织工程牙的构建，除了种子细胞和微环境外，生物活性支架材料的 组织工程牙研制过程中，体内移植实验是检验其发育进程最常用的实 基因治疗是指将外源性正常基因导入靶细胞，纠正或补偿因基因缺陷 人类基因组工程、牙发育学、牙髓生物学和近年来干细胞尤其是成体 釉质是人体最坚硬的组织，釉质的再生显然要比牙本质困难得多，已 牙髓、牙本质在器官发生上共同来自胚胎发育期的牙乳头，在组织结 牙根发育是牙发育后期的重要环节，如何构建组织工程牙根是当前牙 牙周组织包括牙龈、牙骨质、牙周膜和牙槽骨四大部分，起着支持和 牙骨质是牙的组成之一，它与牙周膜、牙槽骨均由牙囊组织发育而来 全牙组织工程以构建整颗牙为目的，是上述局部牙构建过程的综合和 牙再生和牙组织工程牙研究的三个关键问题在于，首先是获取具有成 在骨组织工程研究中，应用支架材料可有效的控制组织工程骨的大小 就目前的研究成果来看，组织工程牙再生过程中的间充质细胞来源问 牙发育过程中涉及多种基因、蛋白和信号通路的调控，形成了庞杂的 近年来的研究发现:①在出生后的成釉器上皮和牙乳头间充质组织中 由于每个人的白细胞抗原( 牙的萌出是多种因素协同作用的结果，其萌出所需的力很小，约为5 牙髓局部的血运重建是再生牙有效发挥功能的关键 牙髓神经的再生可以使牙在受到各种外界刺激时产生保护性反应，有 科学家们早就预言: 1 第一节　概　　论 牙齿发育是由上皮和间充质相互作用的一个过程，其牙根发育的启动 (一)牙髓的发育 牙齿是通过牙胚的发育以及萌出逐步形成具有功能的牙齿的，在此过 (一)牙乳头细胞( (一)牙髓干细胞( 人类正常恒牙萌出后2～3年牙根才发育至应有的长度，3～5年后 牙根尖形成与再生治疗是一种生物依赖性的治疗，使受伤或者没有功 牙髓血运重建术的操作步骤大致如下:在根管彻底清扩以及消毒后， 目前牙髓血运重建术的机制还尚不清楚，通常认为此种治疗是采用干 1. 第一节　概　　论 随着组织工程学、干细胞生物学、发育生物学、分子遗传学及仿生学 生物牙根和牙再生的研究主要包括以下几个方面:①牙发育及分子调 由于牙的结构复杂、发育时间较长以及与周围组织的关系密切，导致 脊椎动物的器官发育取决于上皮与间充质之间的相互作用，二者互相 组织工程生物牙根构建策略主要是将特定的种子细胞与适宜的具有特 组织工程生物牙根构建核心要素主要包括生物支架、成牙微环境及种 微环境是细胞在体内赖以生存的局部条件，控制着细胞的增殖、分化 牙形成过程中的干细胞主要可以分为两类 要构建具有功能的生物牙根并在颌骨区发挥功能，必须获得有牙周膜 (一)咬合功能重建策略 一、牙根形态和大小控制问题 胚胎干细胞的应用涉及严重的伦理问题争议，异体的胚胎干细胞又可 生物牙根是模拟天然牙通过牙周组织与颌骨形成连接的，因此，牙周 由于个体之间的白细胞抗原差异，进行异体器官或者细胞移植时，常 组织工程牙根构建成功后，如何穿龈而出继而在其基础上进行咬合重 血运重建和神经再生是生物牙根再生的关键步骤之一，其可提供营养 近年来，组织工程和再生医学的飞速发展，人们对于牙缺失修复的要 1. 第一节　血管的细胞及组织学研究 大动脉弹性蛋白及胶原蛋白含量最为丰富，从而赋予弹性大动脉管壁 (一)动脉 血管的营养来源有两个 血管壁内有一些特殊的感受器，如颈动脉体、颈动脉窦和主动脉体 动脉管壁结构的发育到成年时才趋完善 血管损伤的致残率、死亡率均较高，往往会造成患者肢体缺血坏死而 细胞种类、数量、代数、分化阶段、细胞供体年龄等对于组织工程构 组织工程化血管产品是具有三维形状和空间结构的组织或器官，与传 血管组织工程构建的三要素是种子细胞的选择，支架材料的选择(非 至今，组织工程血管的性能虽然随着研究的不断深入，技术的不断改 目前组织工程血管的研究还大部分集中于组织工程血管构建的基础研 2004年，Toshiharu 一、组织工程血管发展方向 组织工程化血管最终应用于临床仍存在许多需要解决的问题:体外实 1. 第一节　视网膜的医学基础 血-视网膜屏障( 一、视网膜色素变性 视网膜母细胞瘤( 黄斑在视神经盘的颞侧0. 视网膜血管性疾病指的是一系列影响眼部血管的眼疾，与病患现有的 一、视网膜多能细胞 胚胎干细胞( 骨髓来源干细胞在视网膜中应用主要集中于两类:一是单核细胞，二 在iPS细胞之父———山中伸弥获得2012年的诺贝尔医学奖后 有几个原因使得对眼疾病展开干细胞治疗看起来充满了希望 1. 肌肉和肌腱是肌肉骨骼系统的组成部分，在人体运动功能中发挥着重 肌腱( 一、肌肉损伤 肌肉损伤后会诱导几个不同阶段的愈合过程，主要有退化、炎症和再 (一)生长因子 肌肉组织工程，是以肌细胞为主体，选择恰当的支架材料，将种子细 (一)支架材料的特点 一、肌腱的损伤 (一)肌腱的修复方式 肌腱损伤的自然修复虽然可以在某种程度上恢复肌腱的功能，但是在 肌腱与其他组织(如骨、软骨)相比有其自身的特性，因此组织工程 支架材料是组织工程肌腱的关键，不仅为种子细胞的迁移、生长和增 将组织工程支架材料与各种促进愈合因子复合后，可以控制愈合反应 肌腱的发生和形成始终处于力学环境中，周期性的力学刺激可以有效 (一)屈肌腱 (一)腱鞘损伤 1 第一节　胃肠道的结构与功能 (一)胃的解剖形态和结构 (一)小肠的结构 (一)大肠的形态学特点 目前有两种传统的方法代替胃肠道缺失或严重受损的部分 (一)胃癌及胃切除术面临的问题 (一)小肠外科现状 (一)大肠疾病及临床症状 虽然器官移植在治疗患有终末期器官功能衰竭和大规模组织缺损的患 1 第一节　胰岛的结构与功能 (一)腺泡的结构 一、胰岛的损伤 糖尿病( 诱导胰岛干细胞、胚胎干细胞、诱导多潜能性干细胞或成体干细胞向 一、胰岛再生中的问题 糖尿病常显示出合成胰岛素的β细胞自身免疫性破坏或功能减退的特 早在胰岛素的发现之前，医生就在探索胰腺替换策略治疗糖尿病的可 1. 第一节　概　　述 (一)松果体 一、再生与腺体再生 下面就各种腺体的再生和组织工程研究情况进行阐述(重点介绍研究 人体有多种腺体存在，在人体生长、发育中起着重要的作用 1 众所周知，肝脏具有强大的再生能力，如此强大的再生能力在希腊神 肝脏是人体最大的腺体，它在人的代谢、胆汁生成、解毒、凝血、免 一、肝脏发育的基本过程 与机体内其他器官发育一样，肝脏的发育是一个非常复杂的过程，由 一、肝再生过程简述 干细胞的研究及临床应用是现代医学和生物学领域中最令人注目的前 肝脏再生是肝脏对自我的一种强大的保护功能，肝再生过程由于所受 细胞外基质( 肝脏中除存在大量的功能性的肝实质细胞外，还存在肝脏非实质细胞 肝炎、肝硬化、原发性肝癌、先天性代谢性肝病等难治性、终末期肝 人工肝支持系统( 组织工程( 1. 第一节　泌尿系统的结构和功能 输尿管上接肾盂，下连膀胱，是一对细长的管道，呈扁圆柱状，管径 膀胱是一个储尿器官 尿道是从膀胱通向体外的管道 近年来，随着分子生物学技术的迅猛发展和广泛应用，研究者们将以 (一)肾脏干细胞 血液透析机是一种能代替部分肾功能，清除血液中的有害物质，并纠 (一)生物人工肾小球 一、组织工程尿道的研究进展 (一)支架材料 1 第一节　血管新生和发生过程及分子调控机制 血管发生( 血管生成是指在已有的血管基础上，血管内皮细胞以出芽的方式扩增 血管生成是由多种细胞因子和细胞参与的动态的、协调的过程 动脉生成是在已存在的血管丛侧支小血管扩大形成较大血管的过程， 一、组织工程血管化的相关因素 组织工程组织的血管化是组织工程组织在体内存活并发挥功能的重要 在组织工程技术的发展之中，血管化技术是非常重要的问题 一、可用于血管再生的种子细胞 细胞治疗是血管再生治疗中主要的治疗手段，可通过移植细胞促进缺 1.杨怡.细胞生物学.北京:人民卫生出版社，2005. 人类中枢神经系统( (一)神经干细胞 一、细胞治疗 自体及异体神经组织移植的种种局限使得人们将目光转向了其他更多 (一)药物治疗 一、脊髓损伤的治疗 在神经退行性疾病的治疗中，干细胞尤其是神经干细胞发挥了重要的 角膜退行性变往往导致患者视觉的永久丧失，而对于这一疾病，目前 在美国，脑血管疾病的致死率已跃居第三 虽然对于神经再生的研究可追溯至1913年，但是直到以细胞和分 1. 第一节　心肌的组织学结构 心肌缺血和梗死是临床较常见疾病，严重威胁人类健康 支架材料，作为组织工程构建物的基本部分，有两个方面的意义:一 在心肌组织工程研究中，科研人员开展了大量研究以使体外培养环境 (一)细胞-细胞的相互作用 (一)组织工程心肌的移植 随着我国人口的快速老龄化，伴之而来的可能是心血管疾病的大流行 总的来说，心肌与心脏再生仍然面临着巨大的挑战，体外构建出一个 第四十章　脱细胞ECM 脱细胞ECM支架可以来源于各种同种异体或异种组织和器官，包括 为了获得接近天然性能的ECM支架，组织中的细胞应通过脱细胞处 脱细胞ECM产品用于组织的修复与重建再生，需要具有良好的生物 自20世纪六七十年代开始，大量的脱细胞ECM产品被开发出来， 脱细胞ECM已经在临床前的动物实验研究和人类临床研究中被广泛 肌腱和韧带损伤是影响患者生活质量的常见问题 创伤、开颅手术和脊柱外科手术等往往会导致硬脑膜和硬脊膜破损， 口腔组织再生也多用脱细胞ECM产品，利用这类支架的可降解性， 同种异体或异种真皮基质产品也被广泛用作乳房低位横向植入物和用 第四军医大学组织工程研发中心和深圳艾尼尔角膜工程有限公司共同 1. 第一节　间充质干细胞与免疫调节 在过去的30年，大量的报道集中于研究MSCs治疗疾病的作用， GVHD是一类常见的同种异体组织移植后的并发症，移植排斥反应 以上大量的研究资料表明MSCs具有免疫调节能力，且MSCs在 目前，应用MSCs的临床治疗实验大部分是治疗异常免疫相关疾病 1 第一节　干细胞治疗的研究基础 干细胞研究的重大突破在于: 胚胎干细胞具有两大基本特性:它具有高度自我更新能力，可以在体 造血干细胞移植( 一、美国干细胞管理政策 2001年1月，英国在世界上第一个克隆研究合法化，允许科学家 在日本，干细胞研究是“千年世纪工程”中的核心内容之一 中国卫生部于1999年5月颁布了《脐带血造血干细胞库管理办法 一、干细胞产业特点 (一) 干细胞研究为疾病的治疗提供了崭新的思路 1 软骨主要存在于胚胎早期，是骨发育的雏形，随着发育逐渐被骨取代 根据软骨细胞和纤维的形态结构不同，成熟的关节软骨自关节面向深 关节软骨是位于骨骼与骨骼之间的结构，在负荷的传导和吸收上发挥 关节软骨由软骨细胞、致密胶原和糖蛋白间质构成，无血管、淋巴管 关节软骨承受经骨骼传导的负荷，能够吸收震荡，减小应力，起到缓 由于户外运动增多、交通事故频发、人口老龄化及生活方式改变，关 由于软骨损伤在临床治疗中十分常见，而且会加速关节退变，导致骨 关于软骨细胞修复软骨损伤的原理，Brittberg等提出自体 软骨细胞膜片其主要成分为水分、软骨细胞及其分泌的细胞外基质组 关节腔滑液是软骨获得营养的主要来源途径 随着生物医学工程的发展，组织工程技术被引入到软骨缺损治疗中 1967年Manning等使用胰蛋白酶和胶原酶来消化关节软骨 瑞典Peterson等报告了101例膝关节软骨缺损的患者接受 自从1994年《新英格兰医学杂志》报道5年随访的病例后，基于 一般在自体软骨细胞移植手术后会对患者进行随访观察 尽管组织工程技术在软骨的修复上不断取得进展，但对于以组织工程 1 第一节　角膜及角膜缘的组织学 角膜缘( 一、角膜缘干细胞的鉴定 通过各种方法分离纯化得到的角膜缘干细胞，采用无血清单细胞克隆 角膜缘能够不断地分裂增殖，最终产生终末分化细胞，以补充角膜上 一、角膜的免疫赦免机制 (一)穿透性角膜移植发展简史 一、人工角膜的发展历程 自1987年由美国国家基金会正式提出组织工程这门学科以来，距 1. 第一节　组织工程皮肤的临床应用进展 (一)创面敷料 组织工程产品是由活细胞与可降解生物材料制作的人工细胞外基质复 (一)烧伤 一、组织工程皮肤的产业化 作为全世界最成功的商业化组织工程产品，在其产业化过程中仍需要 组织工程医疗产品不同于传统意义上的医疗器械或生物制品，具有特 近年来组织工程皮肤已取得可喜的进步并初步应用于临床 1 牙周炎( 口腔以外组织来源的干细胞，即非口腔来源的干细胞，如骨髓间充质 生长因子是一类生物活性因子，在牙周组织再生中发挥着重要作用， 从组织工程学的角度来分析，借助载体材料，信号分子(如生长因子 器官和组织中的细胞，其行为不仅取决于细胞内的基因序列，在很大 生物材料的选择对于支架系统的设计和发展极其重要 典型的牙周组织工程是指获取自体的组织(如牙周膜)，通过良好的 如果牙周组织缺损范围较大，已经不能被自体机制所修复，那么借助 图46-2　牙周组织工程中的无细胞疗法和细胞疗法 组织工程学是材料学、生物学、医学交叉的一门学科，对支架材料的 1. 所有的组织工程产品植入机体后都会激发宿主免疫反应 单核细胞在移植的生物材料周围会分化为巨噬细胞 合成的生物材料，如陶瓷、多聚化合物、金属材料等不会激发宿主的 体外研究可以观察到T淋巴细胞可以黏附到合成材料上 生物材料与宿主免疫反应的相互作用通常伴随着ECM的存在 含异体细胞的组织工程产品与异体组织、器官移植的原理是一致的 异体移植免疫排斥反应可分为刺激、增殖与分化三个阶段 1 分子生物学、生物技术以及组织工程等领域的研究成果不仅能广泛应 欧盟及其成员国出台了一系列有关动物实验的地方法规以及相关文件 对于化妆品安全评估，传统的动物实验方法不仅面临伦理方面的压力 皮肤作为人体最大的器官及抵御环境的主要屏障，保护整个身体免受 经皮吸收是指化合物穿透皮肤的过程，可以分为三个步骤 传统的动物实验，如Magnusson 眼刺激测试的动物实验采用Draize方法，将受试物质接触动物 光毒性是指皮肤接触化学物质后暴露于特定波长的光线辐照下所产生 在化妆品备案或注册中还需要进行如遗传毒性，毒性动力学和代谢， 化学药物在开发过程中需要大量的动物实验对药物中间体、成品进行 体外测试方法的核心目标是在体外模拟体内组织、器官以及系统对受 3D细胞培养系统能够实现细胞的定向分化和组织结构的形成，这是 1 第一节　抗衰老研究现状 (一)细胞的抗衰老研究 组织工程的三大要素即为生物材料、种子细胞以及各种生物因子，组 在抗衰老领域中，应用最为广泛的生物因子可能还是前面所提到的H 组织工程技术中可以采用的种子细胞种类很多，根据所需构建的组织 目前组织工程产业发展仍较为缓慢，世界范围内的真正意义上的生物 再生医学技术主要是在体内依靠成体细胞或干细胞技术，对人体各种 目前有大量医疗机构或高科技生物企业在研究自体或异体干细胞治疗 抗衰老与抗癌症基因研究关系紧密，目前发现的部分抗癌基因如p1 (一)产业化概述 一、抗衰老研究难点 在机体中衰老和再生同时在生物体内存在，衰老的进程大于再生的能 衰老和老年病和慢性病的发生是密切相关联的，二者具有相同的病理 美国FDA依据CFR-title 1. 由于临床积累的经验在时间和空间上存在的局限性以及在道义和方法 实验动物是为人类健康和发展作出贡献和牺牲的生命体，应该得到人 (一)影响动物实验效果的动物因素 20世纪人们就预言21世纪将是一个以生命科学为主宰的时代 采用动物实验来研究植骨材料的成骨能力，避免了在人身上进行实验 骨关节炎( 构建动物心肌缺血模型的方法目前主要有结扎冠状动脉法 肛瘘是一种常见疾病，令患者痛苦不堪，患病率为8. 帕金森病( (一)部分肝切除模型( 临床上人类色慢性肾衰竭( 科学技术的巨大进步，新仪器设备与新材料的飞速发展与更新，新技 人和动物皮肤损伤后的正常愈合是以遗留细小而表浅的瘢痕而告终 由环境因素引起的皮肤老化称为时程性老化或自然老化 牵引成骨( 1.付小兵.现代创伤修复学.北京:人民军医出版社，1999. 随着医学和生物材料技术的不断发展，再生医学产品在替代人体组织 (一)医疗器械( 生物材料和医疗产品的生物学评价有以下几个特点: 一、生物材料或医疗产品的生物学评价应遵循的原则 从20世纪70年代后期开展生物材料生物学评价标准化研究以来， GB/T 生物材料或医疗器械的生物学评价内容包括对现有信息的分析、系列 基本评价试验是指一般情况下应予考虑的基本生物学反应试验。 近年来，随着医疗器械生物学评价研究领域的不断深入发展，以及器 生物材料或医疗产品的生物学评价是确保人体应用安全性的重要前提 1. 第五十二章　细胞大规模培养 (一)细胞大规模培养环境 随着细胞培养技术的发展及其产业化要求，培养的规模越来越大 20世纪70年代以来，细胞培养用生物反应器有了很大发展，种类 微载体系统于1967年被用于动物细胞大规模培养 采用微载体技术进行种子细胞大规模培养，细胞扩增的效率受到诸多 应用微载体细胞培养技术既有利于细胞增生，同时又能维持其上细胞 在过去的三十年里，微载体系统细胞大规模培养技术主要用于生产一 1 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的未分化细胞，主要来源于脐 1998年来，以科技部和国家自然科学基金委员会为主的国家级科 一、细胞相关资料的收集 在培养之前，需要对每一种干细胞系进行评估以确定相应的培养方法 细胞库中的每一株细胞都至少应该经过以下测试: 干细胞系的储存条件应该符合干细胞建库标准 干细胞库应建立不利因素下的细胞系召回和报告制度，其内容应包括 一、机构设置 (一)人员要求 1 在骨髓中存在着间充质干细胞( 一、细胞的取材 (一)常规培养 (一)原代培养观察 目前对BMSCs纯化的方法主要有4种，即密度梯度离心法、全骨 目前，BMSCs鉴定的方法都是通过在培养过程中出现分化表型， 1 脂肪内也含有大量的间充质干细胞( 一、细胞的取材 (一)常规培养 (一)原代培养观察 目前，ADSCs没有发现特异性的表面标志，对它的鉴定方法和思 1 干细胞( 一、细胞培养液和主要试剂 脐带血采集是脐带血分离、保存和研究的首要步骤 脐带血分离技术是建立脐带血库和进行脐带血移植研究的关键环节， 脐带血/祖细胞( 1 脐带间充质干细胞与骨髓间充质干细胞在细胞形态、自我更新和多分 一、脐带血干细胞的保存 脐带血在未来的临床中具有巨大的应用潜力，这一点已毋庸置疑 1. 诱导多潜能干细胞( 一、iPS细胞构建原理 目前，iPS细胞制备简而言之包括以下几个主要步骤:分离和培养 (一) iPS细胞的鉴定主要根据其细胞表面的特异抗原、干细胞特异转录 1. 胚胎干( ES作为未分化的全能多潜能性干细胞，细胞表面表达一些干细胞特 ES细胞在去除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织 一、细胞培养液和试剂 (一)小鼠胚胎干细胞分离与培养 目前，胚胎干细胞的鉴定主要依据胚胎干细胞自身的特性，采用胚胎 1. 组织工程皮肤产品研制的最终目的就是修复因为各种原因导致的皮肤 1 1 微血管内皮细胞在组织再生、创伤愈合以及肿瘤发生发展过程中具有 (一) 倒置显微镜下细胞呈卵圆形铺路石样(图59-4)，免疫组化染色 微血管内皮细胞的培养对于实验条件、经费以及培养者技术均有较高 取新生儿脐带，放在无菌PBS中，4℃保存运输 1 第一节　皮肤、口腔黏膜组成 上皮下结缔组织为皮肤真皮或黏膜固有层，它们借基底膜与上皮牢固 皮肤除了上皮组织和结缔组织外，尚有由表皮衍生而来的毛发、皮脂 一、生理性再生 皮肤或口腔黏膜受损后，其再生过程和修复时间，因局部受损的面积 毛的生长有一定周期性，身体各部位毛的生长周期长短不等 一、上皮干细胞 真皮中多能干细胞( 毛发再生是正常皮肤的重要功能之一，也是组织工程皮肤研究的重点 一、上皮干细胞分离、培养 (一)黏附贴壁法 (一)直接培养法 1. 第一节　神经组织组成 神经胶质细胞( 神经细胞的胞体是神经元的代谢、营养中心 20世纪末神经生物学领域内最重要的进展之一，就是发现了成年脑 神经干细胞( 一、成体组织及胚胎组织神经干细胞的培养方法 人胚胎干细胞( 1. 口腔成体干细胞包括牙周膜干细胞、牙髓干细胞( 一、实验用品 选取临床上19～29岁的需要拔除的健康并完整的第三磨牙，将拔 牙髓干细胞培养采用酶消化法进行牙髓组织的消化，方法如下: 牙髓干细胞在不同诱导剂的作用下，可以分化为多种细胞 Gronthos等利用RT-PCR技术发现DPSCs在mRN 牙髓干细胞能够对特异的环境信号作出反应，或选择向成牙本质细胞 牙髓细胞和成牙本质细胞含有较丰富的碱性磷酸酶，该酶在功能上和 1 2004年，Seo等首次从牙周膜中分离出人牙周膜干细胞( 最初接种的细胞为圆形，呈悬浮状态 一、实验用品 选取临床上19～29岁的因正畸需要拔除的健康并完整的前磨牙， 牙周膜干细胞培养采用组织块法、酶消化法、组织块-酶联合法进行 倒置显微镜下观察，细胞长满至80%～90%，用PBS清洗细胞 取对数生长期的第一代细胞用α-MEM培养基倍比稀释，调整细胞 研究表明牙周膜细胞具有异质性的细胞群，有多种细胞亚群组成，这 分别取筛选培养的人牙周膜干细胞和人牙周膜细胞，按照2×104 (一)免疫细胞化学染色(波形丝蛋白和角蛋白) (一)成骨分化诱导 1. 角膜缘干细胞是位于角膜缘基底部，表现出干细胞特性并持续位于角 一、角膜缘干细胞的取材和培养 角蛋白K3:在众多角蛋白中，角蛋白K3被认为是角膜上皮细胞分 1 羊膜是胎盘结构的一部分，直接与羊水接触 一、羊膜上皮干细胞的原代培养 (一)材料 1. 骨组织由大量钙化的细胞间质和多种细胞组成，后者包括骨细胞、成 骨膜内层含大量的骨祖细胞，而成骨细胞是由骨祖细胞分化而来的， 破骨细胞( (一)主要实验材料 软骨组织具有独特的结构特点，它仅由软骨细胞和细胞外基质构成， (一)鉴定 滑膜是关节病变发生、发展的主要部位 (一)主要实验材料 1. 第一节　骨骼肌细胞培养与鉴定 (一)动物取材 当大部分组织块长出细胞晕，并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代 在骨骼肌组织中含有大量的杂质细胞，其中绝大多数为成纤维细胞与 (一)多核肌管形成 一、实验用品 (一)组织块贴壁法原代培养 当大部分组织块长出细胞晕，并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代 1 (一)形态学观察 (一)平滑肌细胞生长过程 在1912年Burrows与Lewis首次对心脏组织进行培养 心肌组织经胰蛋白酶溶液消化分散后的细胞悬液中含有多种细胞成分 心肌细胞在开始分离时，由于受到生物酶及机械作用的破坏，使刚分 1.培养心肌细胞的形态学观察 1 第一节　肝脏祖细胞简介 一、胚胎肝祖细胞的分离培养 (一)大鼠肝祖细胞的分离培养 近年来，肝脏干细胞受到了广泛的关注，不仅因为其多能性在肝脏移 近年来随着对肝卵圆细胞研究的不断深入，已经确立了一些肝卵圆细 在D-半乳糖胺/2-乙酰氨基芴半肝切除构建鼠肝损伤模型中，Y Golding研究发现，经D-半乳糖胺处理过的鼠肝在肝再生过 目前，尚未找到肝卵圆细胞的特异性标志，可能与其阶段性表达、多 1 ..更多